อิซาเบลเสด็จพระราชสมภพเมื่อวันที่ 2 ตุลาคม ค.ศ. 1470 ที่เมืองดูเอญญาสในแคว้นปาเลนเซีย โดยทรงเป็นพระราชบุตรคนแรกของพระเจ้าเฟร์นันโดที่ 2 แห่งอารากอนกับพระราชินีนาถอิซาเบลที่ 1 แห่งกัสติยา เนื่องจากเป็นพระราชบุตรคนแรก เจ้าหญิงอิซาเบลจึงได้รับแต่งตั้งเป็นเจ้าหญิงแห่งอัสตูเรียสและรัชทายาทในปี ค.ศ. 1476 กระทั่งพระราชมารดาของพระองค์ให้กำเนิดเจ้าชายฆวนในปี ค.ศ. 1478 เจ้าหญิงอิซาเบลจึงเสียตำแหน่งรัชทายาทให้แก่พระอนุชาซึ่งมีสุขภาพไม่ค่อยแข็งแรง